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什么是 FLIM 熒光壽命成像?

簡介：

文章要點:

1.熒光壽命成像（FLIM）技術(shù)用于測量整個樣品熒光壽命的變化。

2.使用脈沖激光器和時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC）來記錄FLIM圖像。

3.熒光壽命成像（FLIM）提供了傳統(tǒng)熒光強度成像無法獲得的額外信息。

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熒光壽命的概念為什么使用FLIM FLIM采集和分析相關(guān)產(chǎn)品

熒光壽命的概念

熒光壽命是指熒光分子在激發(fā)態(tài)停留的時間，這個時間可以反映熒光分子的內(nèi)在屬性和所處的微環(huán)境，與局部熒光團濃度和激發(fā)強度無關(guān)。熒光壽命成像（Fluorescence Lifetime Imaging ，FLIM)）是一種重要的熒光顯微鏡技術(shù)，通常用于研究生物分子間相互作用、細胞中的信號事件或區(qū)分光譜重疊的熒光團。此外，F(xiàn)LIM 可以提供有關(guān)電信號變化、離子和氧含量、溫度、細胞或其環(huán)境中的 pH 值的定量信息。FLIM技術(shù)因具有非常高的靈敏度和分子特異性而廣泛的應(yīng)用生物學(xué)研究及臨床診斷等領(lǐng)域。

圖 Perrin-Jablonski能級示意圖所示，熒光是分子吸收能量后，基態(tài)電子被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)后從第一單線激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時所產(chǎn)生的，而熒光壽命是指分子在單線激發(fā)態(tài)平均停留的時間。分子中處于單線態(tài)的基態(tài)電子能級S0上的電子，根據(jù)Frank-Condon規(guī)則吸收某一波長的光子后，被激發(fā)到單線態(tài)的激發(fā)態(tài)電子能級S1中的某一個振動能級上，這個過程的時間約為10^-15 s；經(jīng)過短暫的振動馳豫過程后（時間約10^-12~10^-10 s），S1態(tài)的最低振動能級上會積累大量的電子。這一狀態(tài)的電子釋放能量回到基態(tài)S0能級。

FLIM的黃金標準是時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC）。TCSPC利用快速秒表測量激發(fā)脈沖與探測熒光之間的時間差。使用高重復(fù)脈沖激發(fā)光激發(fā)樣品，在每一個脈沖周期內(nèi)，最多激發(fā)熒光分子發(fā)出一個光子，然后記錄光子出現(xiàn)的時刻，并在該時刻記錄一個光子，再下一個脈沖周期內(nèi)也是相同的情況，經(jīng)過多次計數(shù)可以得到熒光光子隨時間的分布曲線。

為什么使用FLIM

熒光壽命成像（FLIM）是一種成像技術(shù)，樣品熒光壽命的變化在圖像中產(chǎn)生對比度（圖1）。FLIM廣泛用于生物醫(yī)學(xué)成像，其中組織和細胞用一種或多種熒光染料染色。染料的熒光壽命取決于局部微環(huán)境，F(xiàn)LIM比其他成像技術(shù)（如寬場成像）提供了額外的維度，如環(huán)境信息。FLIM也越來越多地用于研究光致發(fā)光材料，例如對納米材料、太陽能電池和半導(dǎo)體的載流子壽命變化進行成像。

圖1 使用RMS1000共聚焦顯微拉曼光譜儀測量（a）小鼠腸道切片和（b）小鼠腎臟切片的FLIM圖像。

FLIM采集和分析

FLIM采集

熒光衰減是使用時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC）獲得的。在TCSPC中，用脈沖激光激發(fā)樣品，并測量激光脈沖和檢測到的熒光光子之間的時間（圖2a）。該過程重復(fù)數(shù)百萬次，以創(chuàng)建熒光光子計數(shù)與到達時間的直方圖（圖2b）。

將樣品上感興趣的區(qū)域劃分為像素，并使用TCSPC記錄每個像素的熒光衰減（圖2c）。通過移動樣品臺（樣品臺掃描）或激光點（激光掃描）將激光點引導(dǎo)到每個像素上。這個過程按順序發(fā)生，依次記錄每個像素的熒光衰減，以構(gòu)建直方圖數(shù)據(jù)合集。

圖2 （a）使用TCSPC記錄單個光子到達時間；（b）單個像素的熒光衰減直方圖；（c）感興趣區(qū)域內(nèi)逐個記錄像素的熒光衰減直方圖。

FLIM分析

計算每個像素熒光衰減直方圖的熒光壽命。通常用最小二乘法將單指數(shù)模型擬合到每個衰減來計算，以獲得熒光壽命τ（圖3）。將通過擬合獲得的熒光壽命對應(yīng)到顏色圖上，構(gòu)建顏色編碼的熒光壽命圖像。

圖3 計算FLIM數(shù)據(jù)，每個像素的熒光壽命對應(yīng)顏色變化，構(gòu)建顏色編碼的熒光壽命圖像。

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